请教ANNEXIN V-PI法检测凋亡的原理和相关试剂盒使用步骤
有关Annexin -PI凋亡细胞的检测使用的是BIODAI的较多，具体的步骤如下：1) 悬浮细胞：300g，4℃，离心5min，收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃，离心5min，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长(见注意事项)，以防引起假阳性。2) 用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g，4°C离心5min，收集1-5×105细胞。注意:在洗涤细胞时，尽量避免损伤细胞。3) 加入100µl 1×Binding Buffer重悬细胞。4) 加入5µl Annexin V-FITC和5µl PI，轻轻混匀。 5) 避光、室温反应10 min。6) 加入400µl 1 x Binding Buffer，混匀，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
请问流式细胞仪检测细胞凋亡的原理是什么？
一、原理
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、注意事项
1、必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。
2、特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。实验的解决方法：先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。
3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。
4、必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）。
细胞凋亡检测都有哪些方法？我自己做了流式，感觉做不好，想咨询下哪些公司可以做。
流式检测凋亡的方法有很多种，不同的方法适用于不同的细胞类型。目前一个很大的误区就是滥用annexin V +PI来检测各种细胞的凋亡。这个方法是为了检测悬浮细胞，比如白细胞而设计的。贴壁培养，或者直接从组织分离得到的细胞不适合用这个方法检测。因为在处理细胞的时候回造成大量的假阳性。
贴壁细胞可以采用检测caspase活性的方法来反应凋亡，而且方法很简单。目前有caspase底物结合的荧光染料。直接加到细胞培养液里面。细胞摄取后，如果处于凋亡期，细胞内的caspase-3/7激活。，降解了底物，荧光染料释放后进入细胞核，染色DNA，这个细胞在流式检测时就是阳性细胞。
这种试剂盒Invitrogen出的，有好几种颜色可选